野生牛肝菌内生真菌分离鉴定及其生物学特性(二)
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2 结果与分析
2.1 菌株的野生形态特征
从云南省2个地区采摘的3个种的野生牛肝菌子实体,共分离出可培养的牛肝内生真菌23株,通过菌落形态初步判断多数为木霉属,菌内菌分从中筛选出具有菌落形态、定及颜色、其生气味等差异大的物学4株菌种,接种于CPDA培养基上,特性在25℃下培养5d,野生平板生长的牛肝菌落形态、光学显微镜观察的菌内菌分菌丝、孢子形态,定及利用MoticImagesPlus2.0软件进行显微形态(10×100)拍摄,其生如图1所示,物学特征描述见表1。特性
2.2 4种内生真菌菌株ITS序列PCR扩增结果
进一步进行分子生物学鉴定,野生以引物ITS1和ITS4对内生真菌的DNA模板进行PCR扩增,获得4条长度均在410~610bp之间的特异性片段,4株内生真菌的ITS扩增产物电泳结果,如图2所示。
2.3 4种内生真菌菌株的系统发育树构建及分析
利用ITS通用引物对4株内生真菌进行序列扩增得到4条基因序列,序列长度分别是LCTG-12为580bp;LCCK-6为410bp;BSHC18为610bp;BBFO-10为600bp。将以上4条序列分别在NCBI库中进行在线BLAST比对,每种菌下载4~5条同源性高于95%的序列,以测序得到的基因序列为基础,同公共数据库下载的相似序列合并,采用MEGA-X软件,按照neighbor-joiningmethod,经过自举法1000次进行检验构建系统发育树,以此对菌株进行种水平的分类鉴别。4株菌在NCBI中BLAST比对结果显示:在100条序列比对结果中,LCTG-12与76株木霉属序列的序列同源性为99%以上,说明该菌为木霉属;LCCK-6与55株念珠菌属的序列同源性为90%以上说明该菌为念珠菌属;BSHC-18与50株菌寄生属的序列同源性为90%以上说明该菌为菌寄生属;BBFO-10与94株的序列同源性为99%以上。
系统发育树树枝的长短表示各菌株之间的遗传距离,同一支说明亲缘关系很近,以系统发育方法可以对关系较为密切的菌株序列进行较好的判别。结合形态学鉴定及BLAST对比及系统发育树结果:LCTG-12与NCBI数据库中的Trichodermagamsii聚类在同一支上,自检支持率100%,鉴定该菌为盖姆斯木霉;LCCK-6与Candidakruisii聚类在同一支上,自检支持率为100%,鉴定该菌为克鲁伊假丝酵母;BSHC-18与Hypomyceschrysospermus聚类在同一支上,自检支持率为100%,鉴定该菌为黄瘤孢菌;BBFO-10与Fusariumoxysprum聚类于同一株上,自检支持率达100%,鉴定该菌为尖孢镰刀菌。
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