海洋细菌MicrobacteriumesteraromaticumMCDA02产几丁质脱乙酰酶发酵条件优化(二)
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2、海洋菌株MCDA02的细菌酰酶鉴定菌株MCDA02为革兰氏阴性短杆菌(图2b),无芽孢。丁质该菌株在LB固体培养上培养48h后:黄色,脱乙条件不透明,发酵表面光滑湿润,优化圆形,海洋边缘齐整,细菌酰酶中心稍突起,丁质易挑取(图2a)。脱乙条件该菌株明胶酶、发酵吲哚试验、优化硫化氢产生、海洋VP试验、细菌酰酶硝酸盐还原试验、丁质尿素酶、柠檬酸盐均呈阴性,氧化酶、接触酶试验均为阳性(表1)。菌株MCDA0216SrDNA序列提交GenBank(登录号:MH454348),BLAST比对后发现菌株MCDA02与Microbacteriumesteraromaticum的同源性最高。利用MEGA9.0软件通过邻接法构建系统发育树(图3),菌株MCDA02与Microbacteriumesteraromaticum亲缘关系最近,将菌株MCDA02鉴定为Microbacteriumesteraromaticum。目前尚未见酯香微杆菌产几丁质脱乙酰酶的报道。
3、发酵培养基成分对菌株MCDA02发酵产CDA的影响
(1)发酵培养基碳源对菌株MCDA02产酶的影响
碳源对菌株MCDA02发酵产酶的影响如图4,所选的8种不同的碳源中,木薯淀粉为碳源时该菌株产酶最高,其次为乳糖,其相对酶活也达到了70%以上,玉米淀粉相对酶活最低仅有10%。因此最终选用木薯淀粉作为发酵培养基的碳源。
(2)发酵培养基氮源对菌株MCDA02发酵产CDA的影响
氮源对菌株MCDA02生长的影响如图5,所选的11种不同的氮源中,添加蛋白胨时该菌株产酶最高,其次为玉米浆,其相对酶活也达到75%以上,而其余氮源相对酶活均为达到70%。因此最终选用蛋白胨作为发酵培养基的氮源。
(3)发酵培养基无机盐对菌株MCDA02发酵产CDA的影响
无机盐对菌株MCDA02生长的影响如图6,所选的9种不同的无机盐中,添加ZnSO4时该菌株产酶最高,紧接着是KH2PO4,其相对酶活达75%以上,添加CuSO4时相对酶活最低,不足25%。因此最终选用ZnSO4为配制发酵培养基所用无机盐。
4、发酵条件对菌株MCDA02发酵产CDA的影响
(1)发酵时间对菌株MCDA02发酵产CDA的影响
发酵时间对菌株MCDA02生长的影响如图7,发酵时间在36h~48h时,产酶量显著增加。发酵时间处于48h~72h之间时,产酶量增长速度减缓。发酵时间达到72h时产酶量达到最高点,发酵72h后菌株MCDA02产酶量开始下降。
(2)发酵温度对菌株MCDA02发酵产CDA的影响
发酵温度对菌株MCDA02生长的影响如图8,在30℃时菌株MCDA02产几丁质脱乙酰酶的量最高。温度超过30℃时,菌株的产酶量迅速下降,温度到达40℃时,菌株MCDA02的相对酶活低至10%左右。
(3)发酵培养基起始pH对菌株MCDA02发酵产CDA的影响
发酵培养基起始pH对菌株MCDA02生长的影响如图9,随着发酵培养基初始pH的升高,菌株产酶能力随之提升,pH为8.0时,产酶量达到最高。pH继续升高,菌株MCDA02产酶量降低,pH为10.0时,菌株MCDA02相对酶活低至20%以下。
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